Phenotypic diversity and selection maintain Leishmania amazonensis infectivity in BALB/c mouse model

Leishmania are protozoan parasites that show remarkable diversity, as revealed by the various clinical forms of leishmaniasis, which can range from mild skin lesions to severe metastatic cutaneous/mucosal lesions. The exact nature and extent of Leishmania phenotypic diversity in establishing infection is not fully understood. In order to try to understand some aspects of this diversity, we subcutaneously infected BALB/c mice with first and second generation subclones of a L. amazonensis strain isolated from a patient (BA125) and examined in vivo lesion growth rate and antimony susceptibility. In vivo fast-, medium- and slow-growing subclones were obtained; moreover, fast-growing subclones could generate slow-growing subclones and inversely, revealing the continuous generation of diversity after passage into mice. No antimony-resistant subclone appeared, probably a rare occurrence. By tagging subclone cells with a L. amazonensis genomic cosmid library, we found that only a very small number of founding cells could produce lesions. Leishmania clones transfected with in vivo selected individual cosmids were also diverse in terms of lesion growth rate, revealing the cosmid-independent intrinsic characteristics of each clone. Our results suggest that only a few of the infecting parasites are able to grow and produce lesions; later, within the cell mixture of each lesion, there coexist several parasite populations with different potentialities to grow lesions during the next infection round. This may reflect a sort of programmed heterogeneity of individual parasites, favoring the survival of some individuals in various environmental conditions.

Importância da resolvinas na infecção por Leishmania Amazonensis / Importance of resolvins in Leishmania Amazonensis infection

A Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD) é uma manifestação clínica. rara causada pela Leishmania amazonensis que é caracterizada por uma resposta celular. parasitária ineficiente e macrófagos intensamente parasitados nas lesões cutâneas.. Mediadores lipídicos e seus precursores desempenham um papel crucial durante a. infecção por Leishmania. Estudos prévios demonstram que pacientes com leishmaniose. tegumentar, exibem um distinto balanço de eicosanoides in situ e sistêmico.. Recentemente, demonstrou-se que mediadores lipídicos especializados na pró-resolução. desempenham um papel crítico na redução de processos inflamatórios patológicos. induzindo a restauração da homeostasia em diferentes modelos experimentais. Entre. esses mediadores, as resolvinas da série D exibem potente atividade anti-inflamatória e. imuno-regulatória que inclui a inibição da quimiotaxia leucocitária e bloqueio na. produção de citocinas pró-inflamatórias. No entanto, ainda é desconhecido se as. resolvinas desempenham um papel significativo no estabelecimento e persistência da. infecção por Leishmania. OBJETIVO: Nesse estudo, avaliamos os níveis circulantes. de Resolvina D1 (RvD1) em pacientes com leishmaniose tegumentar apresentando a. forma clínica cutânea localizada (LCL) ou difusa. RESULTADOS: Nossos resultados. demonstram que pacientes com LCD apresentam maiores níveis plasmáticos de RvD1. quando comparados a LCL ou controles endêmicos. Além disso, os níveis séricos de. RvD1 em pacientes com LCD se correlacionam positivamente com a Arginase I e TGF-. β, enquanto que inversamente com os níveis sistêmicos de TNF-α. Experimentos. adicionais in vitro utilizando macrófagos humanos revelaram que a RvD1 promove a. replicação intracelular da L. amazonensis por um mecanismo associado a indução da. enzima heme oxigenase-1. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que a via de. produção da RvD1 pode servir como uma potencial estratégia terapêutica para os. pacientes com LCD.

INTRODUCTION: Diffuse Cutaneous Leishmaniasis (DCL) is a rare clinical manifestation caused by Leishmania amazonensis that is characterized by an inefficient parasite-specific cellular responses and heavily parasitized macrophages in skin lesions. Lipid mediators and their precursors play a crucial role during Leishmania infection. Previous works have shown that patients with cutaneous leishmaniasis exhibit a distinct in situ and systemic balance of this eicosanoids. Recently, pro-resolution lipid mediators have been shown to play critical role in dampening pathological inflammatory processes to reestablish homeostasis in a diverse range of experimental settings. Among these mediators, resolvins from D series have been described to exhibit potent antiinflammatory and immune-regulatory activities that include inhibition of leukocyte chemotaxis and blockage on the production of proinflammatory cytokines. However, whether resolvins play significant roles in establishment and persistence of Leishmania infection is currently unknown. AIM: We addressed this question by assessing circulating levels of resolvin D1 (RvD1) in tegumentary leishmaniasis patients presenting localized cutaneous leishmaniasis (LCL) or diffuse disease. RESULTS: We found that DCL patients have higher plasma levels of RvD1 when compared with LCL patients or endemic controls. In addition, the levels of this mediator were positively correlated with arginase-I and TGF-β and were negatively correlated with TNF-α levels. Additional in vitro experiments using primary human macrophages revealed that resolvin D1 promotes the intracellular L. amazonensis replication for a mechanism dependent on induction of heme oxygenase-1 enzyme. CONCLUSION: These results indicate that targeting RvD1 could serve as potential strategy for DCL patients.

Role of Leishmania (Leishmania) amazonensis amastigote glycosphingolipids in macrophage infectivity

The role of glycosphingolipids (GSLs) present in amastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis during infection of macrophages was analyzed, with particular emphasis on GSLs presenting the terminal Galpß1-3Galpa disaccharide. Macrophage invasion by L. (L.) amazonensis amastigotes was reduced by 37 percent when the disaccharide Galpß1-3Galp (1 mM) was added to the culture medium. The putative macrophage receptor/lectin for ß-Gal-globotriaosylceramide (Galpß1-3Galpa1-4Galpß1-4Glc pß1-1Cer) and other structurally related GSLs from L. (L.) amazonensis amastigotes were analyzed by micelles and parasite binding assay to peritoneal macrophage proteins fractionated by SDS-PAGE under nonreducing conditions. Micelles containing purified amastigote GSLs or a suspention of L. (L.) amazonensis amastigotes fixed with 2 percent formaldehyde were incubated with nitrocellulose membrane containing the macrophage proteins transferred by Western blotting. Binding of micelles containing purified GSLs from amastigote forms or fixed L. (L.) amazonensis amastigotes to nitrocellulose membrane was probed using monoclonal antibody ST-3, which recognizes the glycoepitope Galpß1-3Galpa1-R present either in the micelle preparation or on the amastigote surface. Macrophage protein with molecular mass ~30 kDa bound the amastigote GSL and appeared to be a doublet on electrophoresis. The specificity of this interaction was confirmed using fixed L. (L.) chagasi amastigotes, which do not express GSLs such as ß-Galp-globotriaosylceramides, and which do not bind to 30-kDa protein.

Daño ultraestructural del intestino medio abdominal de Lutzomyia ovallesi (Ortiz) (Diptera: Psychodidae) ocasionado por Leishmania (Leishmania) amazonensis / Ultrastrutuctural damage to the middle intestine of Lutzomyia ovallesi (Ortiz) (diptera: Psychodidae) caused by Leishmania (Leishmania) amazonensis

Se estudió el intestino medio abdominal de Lutzomyia ovallesi infectada con Leishmania (Leishmania) amazonensis. Las hembras se observaron a los siete días post- infección, utilizando microscopía de luz de alta resolución y microscopía electrónica de transmisión. Se distinguieron dos tipos de células epiteliales, células digestivas y células secretoras, en el intestino medio abdominal de L. ovallesi, tanto en los insectos controles como en flebotominos infectados. Los resultados muestran además, que L. ovallesi presentó alteraciones en la citoar-quitectura celular del intestino medio abdominal producto de la infección con L. (L.) amazonensis, observándose gran distensión del diámetro de la luz intestinal, degeneración de sus células, pérdida parcial o total de las microvellosidades y engrosamiento de la capa basal de toda la porción del intestino. Las células epiteliales presentaron degeneración vacuolar y mitocondrial y en la luz intestinal se observaron desechos epiteliales. El daño celular observado en el intestino medio abdominal de L. ovallesi, pueden tener relación con la secreción de lectinas y con la formación del gel observado, semejante a una matriz, en el lumen del intestino. Es necesario continuar los estudios para dilucidar aspectos importantes de la interrelación Leishmania-vector.

Action of pentoxifylline on experimental cutaneous leishmaniasis due to Leishmania (Leishmania) amazonensis

In the animal model of leishmaniasis caused by Leishmania (Leishmania) amazonensis there is a complex mechanism of the host-parasite interaction. The present study was performed to interfere with the inflammatory reaction to the parasites, through immune modulation. Female C5BL/6 isogenic mice were used, some of which were inoculated on the right ear and others on the right footpad with 3.10(6) stationary phase promastigotes of the MHOM/BR/PH8 strain of L. (L.) amazonensis, and were allocated in three groups: the first received pentoxifylline 8mg/kg every 12 h, since the first day; the second one received the same dose since the 40th day of infection and a control group that did not receive any treatment. All the ears excised were analyzed to determine the variation in weight between both ears and for histopathological analyses. A quantification of the parasites was done using the limiting dilution assay. A significant reduction of the number of parasites, was observed among the animals treated which had an accordingly significant reduction on the weight of the ears. Pentoxifylline reduced the macrophages propensity to vacuolation and induced a more effective destruction of the parasites by these cells. Moreover, the group that began the treatment later did not show the same effectiveness.

Experimental infection of canine peritoneal macrophages with visceral and dermotropic Leishmania strains

A study was carried out using macrophages cultured from the peritoneal exudate of dogs infected in vitro with three species of Leishmania: L. (L.) chagasi, L. (Viannia) braziliensis and L. (L.) amazonensis with the aim of investigating the growth kinetics and infectivity of these species in the host cell. Results were expressed as the percentage of macrophages infected measured at 24 hr intervals over six days in RPMI - 1640 culture medium at a temperature of 34-35oC. The findings open the possibility of using canine peritoneal cells as a model for the screenning of leishmanicide drugs and to study the pathogenesis of these species.

Leishmaniasis mexicana. Consideraciones epidemiológicas, clínicas y terapéuticas para el médico general / Mexican Leishmaniasis. Epidemiological, clinical and therapeutic considerations for the general physician

La Leishmaniasis (L.) es la enfermedad parasitaria producida por el género Leishmania mexicana, transmitida por las hembras de los dípteros conocidos como flebótomos en Europa y Lutzomyia. A partir de 1994, la movilización de tropas en la selva de Chiapas, ha incrementado los riesgos de exposición a la picadura de dichos insectos, por lo que al reincorporarse a sus unidades o instalaciones militares de origen, el personal padece úlceras crónicas cutáneas y, si el médico no tiene en mente este diagnóstico, se retrasa el abordaje clínico y el tratamiento. Por tal motivo, considero de interés realizar la revisión de aspectos epidemiológicos, clínicos y de tratamiento para actualizar la información del médico general

Multiplicación in vitro de leishmania mexicana en macrófagos de hamsters y ratones infectados y no infectados / In vitro multiplication of leishmania mexicana in macrophages of infected and non infected hamsters and mice

Se evaluó la respuesta de macrófagos procedentes de la cavidad peritoneal de hamsters y ratones a la infección con promastigotos de Leishmania mexicana. También se determinó la curva proliferativa del parásito en cultivos de fagocitos que se obtuvieron en animales sin infección, infectados recientemente y con enfermedad. La multiplicación de Leishmania en los cultivos de animales sin infección previa fue bastante significativa, siendo más notable en macrófagos de los hamsters. En los macrófagos procedentes de animales infectados la proliferación del parásito fue prácticamente inhibida observándose además una mayor destrucción macrofágica

Impacto de nuevas metodologías en el estudio de parásitos: III. Variación genética intraespecie de Leishmania mexicana mexicana y su repercusión sobre la fisiopatogenia de la enfermedad / Impact of new methodologies in the study of parasites: III

Las formas más frecuentes de leishmaniosis en México son la leishmaniosis cutánea localizada (LCL), un padecimiento relativamente benigno, y la leishmaniosis cutánea diseminada (LCD), de evolución generalmente mortal. La caracterización fenotípica de parásitos aislados de pacientes con LCL y LCD ha revelado, que el agente casual de ambos cuadros clínicos de Leishmania mexicana mexicana. Sin embargo la resistencia a medicamentos y la virulencia inesperada en algunos pacientes hacen sospechar una posible introducción de nuevas especies en México o bien mutaciones intraespecie. En este trabajo realizamos un análisis genotípico del kADN de leishmanias aisladas de pacientes con LCL y LCD, mediante endonucleasas de restricción (Hae II.I y Hpa II) y RAPD (amplificacion aleatoria de ADN polimórfico con oligonucleótidos no específicos). Encontramos polimorfismo en las digestiones sugestivas de la introducción de nuevas especies en México, lo cual se tendrá que confirmar con PCR especie-especificos. Mediante el RAPD detectamos una ligera diferencia entre un paciente con LCD y otros con LCL. Esta variación intraespecie pudiera ser una de las posibles causas de diseminación del parásito.

Phagolysosomes induits par Leishmania amazonensis et Coxiella burnetii: modèle pour l´étude de fusion entre grandes vacuoles de pahgocytose / Phagolysosomes induced by Leishmania amazonensis and Coxiella burnetii: a model for the study of merger between large vacuoles of pahgocytose

Actuellement, les connaissances sur l'interaction entre grandes vacuoles de phagocytose sont tres limitées. Il est important de signaler, les travaux pionniers sur la fusion entre les vacuoles contenant différents types des particu1es chez les Acantamcebas et les études sur l'interaction entre les phagosomes contenant le Staphylococcus aureus et les endosomes. L'objectif du travail ici présenté était d'étudier l'interaction entre grandes vacuoles de phagocytose en utilisant les cellules intactes de mammifere, les macrophages ou les cellules CHO ("chinese hamster ovary"). Nous avons utilisé comme vacuoles réceptrices deux types de phagolysosomes, la vacuole parasitophore induite par le parasite Leishmania amazonensis et celle induite par la bactérie Coxiella burnetii (vacuole de Coxiella). Ces grands phagolysosomes ont été choisis parce qu'elles sont facilement repérable au microscope optique et partagent entre elles des caractéristiques similaires. La vacuole parasitophore et la vacuole de Coxiella sont addifiées, contiennent des enzymes hydrolytiques, et il est connu que, les deux vacuoles se fusionnent avec les compartiments tardifs d'endocytose. Dans um premier temps, les vacuoles contenant les particu1es inertes, comme celles dérivées de la levure, les billes de latex ainsi que, les globules rouges fixés ou opsonisés, ont été utilisées comme les vacuoles donatrices. Nous avons démontré que les particu1es dérivées de la levure, le zymosan ou la levure tuée, étaient sélectivement transférées aux vacuoles parasitophores, puisque les billes de latex ou les globules rouges également phagocytés par les macrophages, étaient exc1us de ces vacuoles. D'abord, nous avons établi une méthode en pulse-chasse pour étudier le transfert de particules zymosan aux vacuoles parasitophores dans les macrophages infectés par L. amazonensis. Nous avons démontré que le transfert était vectoriel et quantal. Les études pharmacologiques ont montré que l'alcalinisation, par des bases faibles ou l'ionophore monensine, augmentait le transfert. Nous avons également démontré que la toxine cholérique augmentait le transfert probablement par des mécanismes, au moins en partie, dépendants de sa sous-unité B et indépendants de l' AMPc intracellulaire. Nous avons alors montré que la sous-unité B purifiée ou recombinante stimulait le transfert et que d'autres molécu1es qui augmentent l'AMPc intracellulaire, comme les inhibiteurs de phosphodiesterases, la forskoline ou le Br-AMPc réduisaient le transfert. Deuxiemement, nous avons comparé la capadté de fusion entre les vacuoles induites par L. amazonensis ou par C. burnetii dans les cellules CHO, et les vacuoles contenant différents particu1es inertes...

Alteraciones clínicas, hematológicas y parasitarias en la infección experimental con leishmania mexicana / Clinical, hematological and parasitic alterations in leishmania mexicana experimental infection

En la infección experimental con leishmania mexicana de animales susceptibles y resistentes se analizaron diversos parámetros clínicos, hematológicos y multiplicación parasitaria durante un período de 11 semanas. El desarrollo de la infección reveló escasas alteraciones en el comportamiento general de los animales así como en las determinaciones del peso. hematocrito y fórmula blanca. En ninguno de ellos se encontró visceralización del parásito. La proliferación de leishmania fue mas manifiesta en los hamsters mientras que en los ratones se obtuvo básicamente dos tipos de multiplicación denotando en este huésped una variable susceptibilidad individual

Infection of BALB/c, C57Bl/6 mice and F1 hybrid CB6F1 mice with strains of leishmania mexicana isolated from Mexican patients with localized or diffuse cutaneous leishmaniasis

Mice from the syngeneic strains BALB/c, C57Bl/6 and (BALB/cxC57Bl/6) F1 hybrids (CB6F1) were infected in the fottpad with six different stains of Leishmania mexicana mexicana isolated from Mexican patients. Three Leishmania strains were isolated from patients with localized cutaneous leishmaniasis (LCL, the benign form of the disease and three from patients with diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL, the malignant form of the disease). In BALB/c mice, four Leishmania strains showed a sustained fast growth from 4 to 5 weeks postinfection until the end of the experiment (15 weeks), and the other two grew slowly up to 10 or 12 weeks after infection and then started to grow faster. In C57Bl/6 mice four Leismania strains showed a limited to moderate growth up to 6 to 11 weeks postinfection and then started to decrease. One strain showed a moderate growth during the entire experiment and one strain grew as fast as in BLB/c mice up to 11 weeks postinfection and then started to decrease. The CB6F1 hybrid behaved like the C57Bl/6 parent strain with five Leishmania strains but was much more resistant to one Leishmania strain than the C57Bl/6 mice. Sex of the mouse did not influence the outcome of infection. One important purpose of this work was to see if the Leishmania strains that cause DCL are intrinsically more virulent than those that cause the benign form (LCL). Although important variations in virulence among the Leishmania strains were observed, especially in BALB/c mice, they were not correlated with the type of disease caused in humans

Estudio comparativo sobre el curso de la infección experimental por leishmania SP en varios modelos vertebrados / Comparative study about the course of the experimental infection by leishmania SP in several vertebrate models

En este trabajo, se determinó el curso de la infección por leishmania en tres modelos vertebrados (perro, didelphis marsupialis y hámster). Se estableció una marcada diferencia en la infectividad y en las características de las lesiones. Ulceración, metástasis, visceralización y muerte se produjo en los hámsteres y lesiones discretas en diferentes partes de la piel se observó en los perros y didelphis marsupialis al ser inoculados con L. garnhami, L. braziliensis y L. mexicana. La posibilidad de los hemocultivos y aspirado ganglionar de D. marsupialis inoculado con promastigotos de la cepa OC de L. mexicana permiten además establecer que los patrones de desarrollo de la infección en los animales domésticos y silvestres son distintos al observado en los hámsteres

Leishmaniose cutânea experimental: III. Aspectos histopatológicos do comportamento evolutivo da lesäo cutânea produzida em Cebus apella (Primates: Cebidae) por Leishmania (Viannia) lainsoni, L. (V.) brasiliensis e L. (Leishmania) amazonensis / Experimental cutaneous leishmaniasis: III. Histophatological aspects of the evolutive behavior of the cutaneous lesion induced in Cebus apella (Primates: Cebidae) by Leishmania (Viannia) lainsoni, L. (V.) braziliensis and L. (Leishmania) amazonensis

Estudaram-se os aspectos histopatológicos relativos à evoluçäo da infecçäo experimental produzida em Cebus apella (Primates: Cebidae) por Leishmania (V.) lainsoni, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis. O exame microscópico de biópsias seqüênciais, obtidas dos animais a intervalos definidos d etempo (a primeira, âs 48 ou 72 horas após a inoculaçäo, e as seguintes, a cada 30 dias), mostrou que o desenvolvimento das lesöes, independente da espécie de Leishmania inoculada, pass por uma seqüência de etapas a nível tecidual - 1) infiltrado inespecífico crônico; 2) nódulo macrofágico (com numerosos parasitas); 3) necrose das células parasitadas; 4) granuloma epitelióide; 5) absorçäo da área necrosada (às vezes formando granuloma de corpo estranho); 6) infiltrado inespecífico crônico residual); e 7) cicatrizaçäo - que representaria a formaçäo e a resoluçäo das lesöes. Discutiram-se também os prováveis mecanismso imunopatológicos que determinaram esta seqüência de eventos e sua possível semelhança com a evoluçäo das lesöes na leishmaniose tegumentar humana

Comportamiento experimental del Sporothrix schenckii y la leishmania mexicana en el hamster / Experimental behavior of Sporothrix schenckii and leishmania mexicana in hamsters

La descripción macroscópica del proceso de patogénesis en hamsters inoculados subcutáneamente en nariz con Sporothrix schenckii ó Leishmania mexicana spp.proporcionó bases para diferenciar estos dos microorganismo en un modelo animal utilizado comunmente para estudiarlos. Observaciones secuenciales durante 150 días permitieran afirmar que en las infecciones causadas por estos patógenos se presentaron edema y eritema como signos primarios, seguidos de alopecia, necrosis y ulceración. La producción de pus fué una característica distintiva para el S. schenckii. Estos signos clínicos se observaron más temprano en la esporotricosis que en la infección por L.mexicana, mostrando diferencias estadísticas significantes en días promedio de aparición. El presente trabajo muestra que las lesiones produzidas tanto por el S.schenckii como la L. mexicana en este modelo experimental comparten signos clínicos, pero el tiempo de aparición de los mismo y su frecuencia relativa permiten diferenciarlas. Las condiciones de inoculación como: cepa de los microorganismos, dosis del inóculo, sitio y via de inoculación, deben tenerse presentes en la evaculación de su comportamiento experimental

Cutaneous leishmaniasis in germfree, gnotobiotic, and conventional mice: nota prévia

A leishmaniose tegumentar foi muito mais grave em camundongos convencionais e convencionalizados do que em seus pares isentos de germes ou gnotobióticos. Usou-se um inóculo de Leishmania mexicana amazonensis

Experimental infection of Lutzomyia longipalpis fed on a patient with cutaneous leishmaniasis due to Leishmania mexicana amazonensis

Os autores lograram infectar flebótomos em um caso humano de leishmaniose tegumentar americana fazendo fêmeas de Lutzomyia longipalpis se alimentarem em paciente com lesöes devida à Leishmania mexicana amazonensis

Expresión y supresión de la respuesta inmune en la Leishmaniasis cutánea crónica experimental / Expression and suppression of immune responses in chronic experimental cutaneous Leishmaniasis

Estudiamos la respuesta demorada de hipersensibilidad (RDH) y la inmunidad protectora (IP) en ratones BALB/c, muy susceptibles a la Leishmania mexicana. En los animales inoculados con 10 amastigotes, la expresión y supresión de ambas respuestas fue un evento relacionado con la evolución de las lesiones. Aquellos con infecciones de corta evolución (6-8 semanas), presentaron RDH contra el parásito y sus células esplénicas pudieron transferir IP a receptores singénicos. Sin embargo, la RDH fue inhibida progresivamente a medida que las lesiones aumentaron de tamaño, y la encontramos totalmente suprimida en las infecciones de larga evolución (más de 18 semanas). La supresión de la RDH pudo vincularse a una población de células esplénicas, con características de células T y con especificidad antigénica para la RDH que ostentan los animales con infecciones de corta evolución. Ensayos de inmunización SC con promastigotes no multiplicantes de L. mexicana, permitieron estimular RDH en ratones BALB/c no infectados. Esta RDH también fue sensible a la inhibición por células T de animales con infecciones de larga evolución. Los ensayos de IP utilizando células esplénicas de estos animales, mostraron que la inhibición de la RDH y la aparición de células Tsupresoras de la RDH a su vez se acompañaba de la pérdida de la capacidad de conferir IP contra el parásito

Independencia entre la respuesta de la hipersensibilidad tardía y la protección contra Leishmania mexicana pifanoi / Induction of delayed hypersensitivy against Leishmania mexicana pifanoi without simultaneous immunity

Logramos estimular respuestas de hipersensibilidad tardía (RHT) en ratones BALB/c, luego de su inmunización subcutánea con promastigotes de Leishmania mexicana pifanoi muertos por calor. La infusión intravenosa de receptores singénicos con las células esplénicas de donantes inmunes permitió transferir RHT contra los antígenos leishmánicos, transferencia que no se logró cuando las células inmunes fueron previamente tratadas con un suero de conejo antitimocitos de ratón. Cuando analizamos la capacidad de los animales inmunizados para resistir un inóculo con promastigotes viables de L. m. pifanoi, no encontramos en ellos resistencia laguna al parásito, por el contrario, sus lesiones fueron de desarrollo acelerado y alcanzaron un tamaño exacerbado en comparación con las de otros controles no inmunizados